miRNA是一類內源性非編碼單鏈RNA，在體內以前體和成熟體的形式存在，而我們對某種的microRNA的表達檢測的對象是成熟體，microRNA的成熟體長度約為19-25nt，由於其序列和性質的特殊性，我們需要使用與普通mRNA不同的方法對其進行引物的設計。目前主流的方法有兩種：莖環法和加尾法。

基本的原理圖示如上，因為microRNA很短，引物為了方便接下來的檢測我們可以通過具有頸環樣結構的反轉引物先將microRNA進行逆轉錄，然後再將用於表達檢測的3『引物（即圖中reverse）設計在反轉引物上，最後結合mircoRNA的5『序列設計一個5』端的定量PCR引物（圖中Forward）即可。小結一下就是我們需要設計3條引物，一條做反轉錄的頸環引物，和2條用於做表達檢測引物（Forward和reverse引物）。

莖環結構不但能有效地延長 miRNA 的長度，同時它自身互補的構象可以避免與其他同源基因結合，減少了非特異性擴增的幾率。整個引物由 2 部分組成，一個通用的莖環結構和5 ～ 8 個與目的 miRNA 的 3'端反向互補的鹼基。其序列通常為: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3'。其中下劃線部分為莖環自身互補部分。我們可以看看這個通用的莖環結構序列怎樣互補成頸環的。

點擊report中的primer hairpins

報告第一個就是我們通用的一個典型莖環結構了，接下來只需要根據我們的目標microRNA的序列在此序列後加入5-8個鹼基與目的 MicroRNA 的 3'端反向互補即可。

舉個例子：hsa-miR-26a (注意大小寫)

輸入hsa-mir-26a ，點擊go

可以看見有3中成熟體，選著你想檢測的一種，比如：hsa-miR-26a-5p，Get到 sequence，如下

UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU

將U全部改成T

TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT

                                        ATCCGA

把後面的6個鹼基反向互補後加到上述頸環序列3'端，即為：

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCCTA-3'

這樣我們的RT引物就大概可以了。

表達檢測用3'端引物設計（這個最簡單！）

該引物為通用引物，能和頸環序列的一部分結合。

5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'

可以通用

用primer select查看一下Tm

最後據此設計上游5'端檢測引物，上游引物較特殊，是由 5'端鹼基( 模板外) 與 miRNA 特異序列( 模板內) 2 部分組成的。設計上游引物物時，必須注意的是，反轉錄後的擴增反應體系中存在著大量剩餘的反轉錄引物，所以在上游引物設計的時候不能與反轉錄引物有重疊，否則會得到反轉錄引物和上游引物的二聚體。在我們的例子中，不與反轉錄引物重疊的部分的鹼基剩16個，若想使引物長度不變，只能使得上游引物延伸到模板鏈外側。上游引物 5'端的添加鹼基要與目的 miRNA 相適應，不同的 miRNA 序列之間差異很大，5'端添加的這些鹼基不可能適用於所有 miRNA，也就是說它並不具有通用性。所以只能根據具體的實驗做好調整。

這個例子中我們剩下的16個鹼基序列分析一下Tm：TTCAAGTAATCCAGGA， 按照primer select的算法才33度 和通用的3'引物差了16度 ，所以需要在其5'端加入幾個鹼基以增加引物的Tm，5'端添加鹼基後：CGTCCTTCAAGTAATCCAGGA 序列Tm為51度，基本接近了3'通用引物了。

primer select計算一下

最後我們還需要對這個5'引物的特異性進行檢測

進入miRbase

點擊search後輸入我們設計的5'端引物進行blast分析即可。經過驗證，針對hsa-miR-26a-5p的檢測引物和反轉引物都ok了，把序列發給合成公司，準備開工吧！