miRNA是一類內源性非編碼單鏈RNA,在體內以前體和成熟體的形式存在,而我們對某種的microRNA的表達檢測的對象是成熟體,microRNA的成熟體長度約為19-25nt,由於其序列和性質的特殊性,我們需要使用與普通mRNA不同的方法對其進行引物的設計。目前主流的方法有兩種:莖環法和加尾法。
基本的原理圖示如上,因為microRNA很短,引物為了方便接下來的檢測我們可以通過具有頸環樣結構的反轉引物先將microRNA進行逆轉錄,然後再將用於表達檢測的3『引物(即圖中reverse)設計在反轉引物上,最後結合mircoRNA的5『序列設計一個5』端的定量PCR引物(圖中Forward)即可。小結一下就是我們需要設計3條引物,一條做反轉錄的頸環引物,和2條用於做表達檢測引物(Forward和reverse引物)。
莖環結構不但能有效地延長 miRNA 的長度,同時它自身互補的構象可以避免與其他同源基因結合,減少了非特異性擴增的幾率。整個引物由 2 部分組成,一個通用的莖環結構和5 ~ 8 個與目的 miRNA 的 3'端反向互補的鹼基。其序列通常為: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3'。其中下劃線部分為莖環自身互補部分。我們可以看看這個通用的莖環結構序列怎樣互補成頸環的。
點擊report中的primer hairpins
報告第一個就是我們通用的一個典型莖環結構了,接下來只需要根據我們的目標microRNA的序列在此序列後加入5-8個鹼基與目的 MicroRNA 的 3'端反向互補即可。
舉個例子:hsa-miR-26a (注意大小寫)
輸入hsa-mir-26a ,點擊go
可以看見有3中成熟體,選著你想檢測的一種,比如:hsa-miR-26a-5p,Get到 sequence,如下
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU
將U全部改成T
TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT
ATCCGA
把後面的6個鹼基反向互補後加到上述頸環序列3'端,即為:
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCCTA-3'
這樣我們的RT引物就大概可以了。