1.分別於不同isoform將primer設計在不同的位置，確保該primer確實是抓到目標

  isoform，不是抓到別的。

2.isoform(亞型):

  是指由同一段基因經過選擇性剪切(alternative splicing)所產生的不同產物。

  接不同exon，如:

1.antisense oligonucleotide(ASO):

  利用一段由15~25個核苷酸組成的短鏈DNA，他會與特定標靶RNA序列互補，和RNA形成雙鏈結構。之後利用RNase H水解掉RNA，使RNA knockdown。此方法是加入DNA(oligonucleotide)，作用於細胞核RNA level。

  RNase可水解與DNA結合的RNA，無法水解單股或雙股的RNA or DNA

2.siRNA(small interfering RNA，小干擾RNA):

 是一段長20~25個核苷酸的雙股RNA，作用於細胞質，主要參與RNA干擾

（RNAi）現象。與microRNA的作用機制類似。

 作用機制：

(1)dsRNA(雙股RNA)被送進細胞內。

(2)Dicer (一種RNase )將其切成多個小段，仍為雙股，即為siRNA。

(3)隨後這些siRNA片段與RISC(RNA-induced silencing complex)結合。

  RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-結合蛋白（TRBP）組成。

  結合後RNA的兩條鏈分開，其中一條鏈從復合物上分離，成為變為單股，到此才有活性。

(4)有活性的RISC(含有siRNA)的單股結構(antisense)，會在目標mRNA上找

  一段互補序列附著上去，將其切斷，阻礙其進行轉譯，使基因不活化。

(5)切下來的其中一段mRNA 會被某種物質分解。

(6)另一段會被RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)附著，將此段單股RNA變

成dsRNA，新的dsRNA 可以重複上述步驟，製造更大量的siRNA，去干擾更多mRNA的轉譯作用(gene silence)。

3. shRNA(small hairpin RNA，小髮夾RNA):

  他算是在siRNA的上游部分，作用於細胞核。

  利用載體(細菌或病毒)將shRNA導入靶細胞的細胞核內(載體中的U6啟動子可

  確保shRNA的持續表達)，shRNA的髮夾結構可經由細胞內的酶切割機制，切

  割形成siRNA並進入細胞質，之後siRNA再結合到RNA誘導沉默複合物上

  (RISC)，與目標mRNAs結合並將其降解(siRNA機制)。

  shRNA需通過載體導入細胞後，再利用細胞內的酶切機制得到siRNA，最終發揮RNA干擾作 

  用。

4.Morpholino:

  →利用Morpholino oligo

  →Morpholino oligo是一種修飾後的核苷酸，是將六碳環的morpholine接上鹼

    基後，以非離子性的phosphorodiamidate連接而成

  →穩定性高，不需要RNase H

  →通常以電穿孔的方式將Morpholino oligo送入細胞

  →通常用於作用在斑馬魚

  →較難transfect