• 00:00 1.
    Introduction
  • 06:09 2.
    Fig. 1
  • 1:15:36 3.
    Fig. 2
  • 1:33:00 4.
    Fig. 3
  • 1:47:09 5.
    Fig. 4
  • 1:53:31 6.
    Fig. 5
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20200831-lab meeting 易宏
Duration: 2:05:33, Browse: 774, Last Updated: 2020-09-16
Keypoint
  1. Introduction:

    1.KHPS1是一種反義RNA,可藉由在SPHK1(一種源癌基因)enhancer上形成三鏈體RNA-DNA-DNA結構,進而激活SPHK1的表達。

    →proto-oncogene(原癌基因)一般與細胞的增殖有關,他原本是正常基因,當他發生片段丟失、點突變……等等原因後可能因此轉變為癌基因,即為原癌基因。

    2.Enhancer(增強子):

      是一種轉錄調節因子,可增強基因的轉錄

    3. antisense RNA(反義RNA):

      是一種與mRNA互補的單鍊RNA,可通過與mRNA結合來抑制轉錄的進行。

      Sense5’---------3’

      Antisense3’---------5’

    4.lncRNA(long noncoding RNA):

      為長鍊非編碼核醣核酸,是指大於200bp的不會編碼protein的轉錄物(transcript)

      本篇paper提到,在與protein的交互作用方面,lncRNA能夠募集染色質修飾酶(chromatin-modifying enzyme)transcription regulators,可控制特定基因的chromatin state和活性。

      而本文中的eRNA(enhancer-derived RNA)是一種noncoding RNA,可藉由穩 

      enhancer-promoter間的交互作用來激活特定基因的轉錄。

    5.RNA能夠識別並與特定DNA結合,與單鏈DNA雜交形成RNA-DNA duplexes,或是直接與DNA結合形成RNA-DNA-DNA三鏈結構。

      →有形成三鏈體潛力的序列,會在regulatory gene region(:promoterenhancer)過度表現。
  2. 1.
    1233115a7a95c4b34315bb709bcbe77f.png
  3. 2.
    8055c078e9d138e69005b855b6ff03b4.png
  4. 3.
    Fig 1
    99b6688ca814816f63683e457d81fb88.png

    1.分別於不同isoformprimer設計在不同的位置,確保該primer確實是抓到目標

      isoform,不是抓到別的。

    2.isoform(亞型):

      是指由同一段基因經過選擇性剪切(alternative splicing)所產生的不同產物。

      接不同exon,如:114c244e5841293e20096d1cd0390a57.png

     

     

  5. 4.
    gene silencing的方法

    1.antisense oligonucleotide(ASO):

      利用一段由15~25個核苷酸組成的短鏈DNA,他會與特定標靶RNA序列互補,和RNA形成雙鏈結構。之後利用RNase H水解掉RNA,使RNA knockdown。此方法是加入DNA(oligonucleotide),作用於細胞核RNA level

      RNase可水解與DNA結合的RNA,無法水解單股或雙股的RNA or DNA

     

    2.siRNA(small interfering RNA,小干擾RNA):

     是一段長20~25個核苷酸的雙股RNA,作用於細胞質,主要參與RNA干擾

    RNAi)現象。與microRNA的作用機制類似。

     作用機制:

    (1)dsRNA(雙股RNA)被送進細胞內。

    (2)Dicer (一種RNase )將其切成多個小段,仍為雙股,即為siRNA

    (3)隨後這些siRNA片段與RISC(RNA-induced silencing complex)結合。

      RISCArgonaute-2Ago-2)、DicerTAR-RNA-結合蛋白(TRBP)組成。

      結合後RNA的兩條鏈分開,其中一條鏈從復合物上分離,成為變為單股到此才有活性

    (4)有活性的RISC(含有siRNA)的單股結構(antisense),會在目標mRNA上找

      一段互補序列附著上去,將其切斷,阻礙其進行轉譯,使基因不活化。

    (5)切下來的其中一段mRNA 會被某種物質分解。

    (6)另一段會被RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)附著,將此段單股RNA

    dsRNA,新的dsRNA 可以重複上述步驟,製造更大量的siRNA,去干擾更多mRNA的轉譯作用(gene silence)

     

    3. shRNA(small hairpin RNA,小髮夾RNA):

      他算是在siRNA的上游部分,作用於細胞核

      利用載體(細菌或病毒)shRNA導入靶細胞的細胞核內(載體中的U6啟動子可

      確保shRNA的持續表達)shRNA的髮夾結構可經由細胞內的酶切割機制,切

      割形成siRNA並進入細胞質,之後siRNA再結合到RNA誘導沉默複合物上

      (RISC),與目標mRNAs結合並將其降解(siRNA機制)

      shRNA需通過載體導入細胞後,再利用細胞內的酶切機制得到siRNA,最終發揮RNA干擾作 

      用。

    4.Morpholino:

      利用Morpholino oligo

      Morpholino oligo是一種修飾後的核苷酸,是將六碳環的morpholine接上鹼

        基後,以非離子性的phosphorodiamidate連接而成

      穩定性高,不需要RNase H

      →通常以電穿孔的方式將Morpholino oligo送入細胞

      →通常用於作用在斑馬魚

      →較難transfect

    • 00:00 1.
      Introduction
    • 06:09 2.
      Fig. 1
    • 1:15:36 3.
      Fig. 2
    • 1:33:00 4.
      Fig. 3
    • 1:47:09 5.
      Fig. 4
    • 1:53:31 6.
      Fig. 5
    Location
    Folder name
    2020
    Author
    陳逸安
    Branch
    賴亮全教授
    Created
    2020-08-31 12:31:53
    Last Updated
    2020-09-16 16:12:45
    Duration
    2:05:33