• 00:00 1.
    做膠
  • 00:42 2.
    電泳
  • 01:35 3.
    Transfer
  • 07:35 4.
    Blocking
  • 08:06 5.
    壓抗體
  • 09:09 6.
    照膠
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western blot
Duration: 11:46, Browse: 8328, Last Updated: 2019-08-01
Attachment(s):
Keypoint
  1. 1.
    做膠
    1. 架膠台,加ddH2O放一段時間看有沒有漏水,接著把水倒掉
    2. 15ml離心管裝試劑配膠,加完mix上下invert搖一下(勿劇烈搖晃,避免產生太多泡泡)

    下膠 total10 ml

     

    8% gel

    10% gel

    12% gel

    H2O

    4.6

    4

    3.3

    30% acrylamide/Bis

    2.7

    3.3

    4

    1.5 M Tris (pH 8.8)

    2.5

    2.5

    2.5

    10% SDS

    0.1

    0.1

    0.1

    10% APS

    0.1

    0.1

    0.1

    TEMED

    0.006

    0.004

    0.004

    下膠 total3 ml

    H2O

    1.68

    30% acrylamide/Bis

    0.51

    0.5 M Tris (pH 6.8)

    0.75

    10% SDS

    0.03

    10% APS

    0.03

    TEMED

    0.003

    1. 下膠加約8 ml到綠色下面,然後加Isopropanol去除氣泡,接著倒掉
    2. 下膠凝固(約一小時)後加上膠,上膠加約2 ml加到玻璃頂部,插齒梳
  2. 2.
    電泳
    1. 把膠裝到電泳槽,薄玻璃朝內,只有跑一邊膠時要拿塑膠片放另一面
    2. 倒入running buffer,裡面加新鮮的外面槽加reuserunning buffer,拔尺梳
    3. Load maker3~5μlload sample 15μl,空的wellsample buffer
    4. 上膠:75V (20min);下膠:120V (40min)
  3. 3.
    Transfer
    1. 拿量筒去rinse,加transfer buffer 80 ml,加水補到800 ml (1:10)
    2. 把剛剛的transfer buffer裝到大血清瓶,冰4預冷
    3. Transfer槽放大冰盆,周圍裝滿冰
    4. 2張圖畫紙、一張PVDF
    5. 200 ml甲醇到小塑膠盒,PVDF用鑷子夾進去
    6. transfer buffer倒進大塑膠盒,把膠割下來(切膠不可以用劃的,要用切的)
    7. 從下到上依序放白網-菜瓜布-圖畫紙-PVDF-gel-圖畫紙-菜瓜布-黑網

    (注意PVDF和膠之間不可以有氣泡,如果有氣泡要把氣泡壓出來)

    1. 放到transfer槽,黑色對黑色,剛剛的甲醇、transfer buffer倒進transfer
    2. -80冰箱拿小冰袋放入transfer
    3. 通電調至350mA1 hr
  4. 4.
    Blocking
    1. 把圖畫紙+PVDF+gel剪成需要的大小放到塑膠盒
    2. 每一格加lightning blocking蓋過membranerotate 50 rpm5 min
    3. lightning blocking吸回去reuse (可以重複用大概10)
    4. TBST wash,加蓋過membranerotate 50 rpm5 min
  5. 5.
    抗體binding
    1. 配一抗,用TBST dilute
    2. 加一抗,rotate overnight
    3. 倒掉一抗,TBST wash 3次,每次加蓋過membranerotate 50 rpm10 min
    4. 加二抗,加到蓋過membranerotate 50 rpm1 hr
    5. wash 3次,每次加蓋過membranerotate 50 rpm10 min 
    6. TBST蓋過membrane
  6. 6.
    照膠
    1. 照膠要前一天先去14樓預約
    2. 帶白色小盤子、鑷子、pipettetipeppendorf、試劑(HRPstop solution)
    3. membrane夾到小盤子
    4. HRPstop solution=11加入eppendorf混和,淋在membrane
    • 00:00 1.
      做膠
    • 00:42 2.
      電泳
    • 01:35 3.
      Transfer
    • 07:35 4.
      Blocking
    • 08:06 5.
      壓抗體
    • 09:09 6.
      照膠
    Location
    Folder name
    Western blot (冠儀版本)
    Author
    李冠儀
    Branch
    賴亮全教授
    Created
    2019-08-01 10:47:37
    Last Updated
    2019-08-01 15:08:33
    Duration
    11:46