要用到的試劑：PBS、medium、Trypsin、cell dye、FBS、DMSO
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1.
凍細胞
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2.
放到 37 度C incubator 5 分鐘
Play Video: http://llai.cm.ntu.edu.tw/media/550
影片來源:
YouTube 或做實驗時用手機錄影
做法:
學長姐教的時候，學習的人負責錄影，並於事後
- 整理錄影
可以加字幕重點 (可以用 EverCam)，也可以移除聲音 (降低心理門檻) 或配上背景音樂 - 提出問題 (例如，影片中哪些看不懂，可以用文字補充在重點說明)
- 整理實驗步驟，與要特別注意的地方 (從影片中截圖、整理文字重點)
- 最後再由教的人負責確認
參考的流程:
- 透過重點文字 + 圖片的編輯，補足影片細節的不足
- 容易造成實驗失敗的地方 (過去曾發生的案例)，特別用紅色字標示
- 設計檢核清單，幫助新人實驗時可以有明確的指引 (建立工作時，複製檢核清單)
- 設計課程，將紅色的標示的重點，變成測驗題目
- 持續累積經驗，用 FAQ 將遇到的問題整理
Keypoint
- 實驗前的準備
- 1.解凍容器，把冰盒拿出來退冰目的:避免盒子太冰，細胞會瞬間凍壞要退冰多久?一定要退到室溫，建議至少提前 30 分鐘拿出來退冰比較保險
- 2.準備 PBS、medium、trypsin步驟:
- 準備 PBS、medium、trypsin
- 噴酒精消毒瓶子外圍 (避免污染)，用紙巾擦乾
- 放到工作台
- 鬆開瓶蓋 (方便單手操作，注意: 不可以將蓋子完全打開放旁邊，避免污染)
- 開始實驗
- 3.把原來的 medium 吸掉目的:
- 舊的培養液裡面有廢物和死細胞 (保證品質和避免污染)
- 要換成抗凍的培養液
實驗步驟:- 拿細胞
- 要換新的 tip，避免污染
- 把原來的 medium 吸到廢物桶
- 4.PBS wash，吸掉目的:將舊的 medium 和廢物洗乾淨實驗步驟:
- 吸取 3ml PBS
- 沿著 dish 壁加入 (為了避免直接沖到細胞)
- 加入後，蓋上蓋子輕輕旋轉，使 PBS 充分 rinse 所有細胞
- 吸掉 PBS
- 吸取 3ml PBS
- 5.把細胞切下來實驗目的將細胞從 dish 上切下來實驗步驟
- 加 1 ml trypsin (直接「散佈」加在 dish 底部)
- 旋轉 dish，確保細胞都有接觸到 trypsin
- 放 37oC incubator 5 min (注意不要放太久)
- 利用空檔標示凍細胞要用的 tubes
- 加 1 ml trypsin (直接「散佈」加在 dish 底部)
- 6.從 dish 中取出 cell
- 從 incubator 拿出剛剛的 dish
- 加 2 ml medium
- 沖一沖 dish，mix 均勻
特別注意:
dish 傾斜 + 來回沖、吸的動作，確保將 cell 沖下來
- 把 medium + cell 裝到 15ml 離心管
- 以下尚未編輯
- 7.低速離心5 min，吸掉上清液
- 8.加1 ml medium，數細胞，取約10^6個細胞
- 9.800 ul細胞+ 100 ul FBS加進凍細胞tube
- cell+ medium + FBS + DMSO = 1ml
- 10.加100 ul DMSO (要避光)
- 11.Tube放進冰盒，冰到 -80℃
Checklist
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00:00
1.
凍細胞
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00:46
2.
放到 37 度C incubator 5 分鐘
- Location
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- Folder name
- Cell Freeze
- Author
- 李冠儀
- Branch
- 賴亮全教授
- Created
- 2019-06-05 10:16:00
- Last Updated
- 2019-06-07 20:26:27
- Duration
- 03:32
- Reference
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